연구성과

MTT 분석법은 세포 대사 활성을 평가하기 위한 비색 분석법입니다.

MTT assay는 미토콘드리아의 환원효소에 의해 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 시약이

불용성의 보라색 포르마잔(Formazan)으로 변환되는 원리를 이용한 분석법입니다.

살아 있는 세포에서만 환원 반응이 일어나므로, 세포 생존율을 정량적으로 평가할 수 있습니다.

그리고 MTT 시약은 빛에 민감하기 때문에 MTT 분석은 일반적으로 어두운 곳에서 수행됩니다.

WST-8 assay 란?

WST-8은 미토콘드리아 기능을 평가하고 세포생존 및 세포독성을 연구하기위해 일반적으로 사용되는 실험방법 중 하나로, 주로 세포주나 조직에서 활성산소와 미토콘드리아 기능을 측정하는데 사용됩니다.

WST-8은 안정성이 높고, 세포독성이 낮으므로 24~48시간 동안 세포 처리가 가능하며, 세포생존율, 증식, 세포독성 분석의 목적으로 사용이 가능합니다.

사용되는 Cell line 목록

1) MRC5 (인간유래세포, 섬유아세포)/기본 세포주

2) CCD986SK (인간유래세포주- 주름/보습 세포)/기본세포주

3) RAW264.7 (마우스 면역세포주 – 항염 관련 실험 진행)

4) B16F10 (마우스 흑색종 세포- 미백관련 실험 진행)

5) HFDPC (모유두세포- 모발시험 진행)/가격에 +30만원

6) L929 (마우스 섬유아세포 – 의료기기 용출 실험에 주로 사용됨)

7) 3T3L-1 (지방전구세포- 항비만 및 당뇨 실험 진행)

* 분화유도 기간 10일 추가 필요

8) HepG2 (간암세포주 – 지방간 및 간 관련 실험 진행)

시료정보

분말 (DMSO를 용매로 하여 액상형태로 용해 가능), 기기 및 Gel (배지에서 용출 가능)

* 물에 녹는 시료는 세포가 터져버리는 용혈 현상 발생

농도

1) MTT의 경우 5가지의 농도 진행

(원하는 농도가 있다면 제시, 없으면 최대농도 100 uM, 100 ug/ml에서 2배희석하여 5개 농도)

* 농도가 있는 경우 (uM, mg/ml)

* 농도가 없는 경우 원액을 100 %으로 두고 1%가 최대 처리 농도 (안내 필요)

시험방법

① 세포는 37 ℃, 충분한 습도, 5 % CO₂ 인큐베이션 시켜 유지한다.

② 96 well에 cell seeding (각 세포마다 seeding 되는 세포수 상이)

③ 24 시간동안 배양 후 배양액을 제거한다.

④ cell에 농도별로 희석된 시료 처리 (100 µl) – 4개 이상의 농도로 진행

⑤ 24 시간동안 배양 (요청되는 시간으로 반응 진행, 없으면 24시간)

* 대조구엔 용매(DMSO)만 처리, 용출의 경우 공시험액

* 세포 형태 변화에 대한 현미경적 평가 (보고서 요청의 경우 포함된다)

⑦ 배양액을 제거하고 100 µl (5mg/ml) 또는 WST-8 용액을 첨가하여 3-4시간 배양한다.

* MTT 용액 제조 (5 mg/ml: Media = 1:9), WST-8 용액은 원액 반응

⑧ MTT 용액을 제거한 뒤, 각 well에 100 µl DMSO 첨가 (WST-8의 경우 DMSO 과정 생략)

⑨ 플레이트 흔들고 30 min 반응

⑩ 540 - 570 nm (MTT), 450 nm (WST-8) 흡광도 측정

평가 특이사항

세포생존률 (Viabillity-%) = (시료 처리구의 흡광도 값/대조구의 흡광도) x 100

* Viab.% 값이 낮을수록, 시험 시료의 잠재적인 세포 독성은 더 높아진다.

[액상 및 농도가 존재하는 경우]

생존율이 공시험액의 70 % 미만(<70 %)으로 감소될 때, 잠재적으로 세포 독성이 있는 것이다.

[용출시험의 경우]

시험 시료 용출물의 50 %로 시험한 경우 용출물 100 %로 시험한 것과 비교하여 생존율이 최소한 같거나 더 높아야 한다.