미생물 분석시험에서 실행하는 밸리데이션의 대표적인 예시는 흡광도를 이용한 CFU 계산이 있습니다.
그에 대해 정리하면 다음과 같습니다.
1. 밸리데이션 계획의 수립: 미생물 생장곡선(growth curve) 기준, 생균수와
흡광도가 비례관계를 갖는 대수증식기(exponential(=log) phase)에 해당하는 배양시간(12-24)시간 중
특정 시간을 설정하고, 그 시간에서 균 배양액의 흡광도를 spectrophotometer를 사용하여
600~660 nm에서 측정하고 동시에 Colony Forming Unit(CFU)를 측정하여
그 둘 사이의 standard curve를 작성한다.
또한 미생물 생장에 영향을 주는 온도, pH, 수분활성도, 산소요구량, 미량원소, 항생제
첨가여부 등을 설정하여 향후 시험에서 결과가 일정하게 나올 수 있도록 한다.
2. 밸리데이션 실행: standard curve를 작성할 배양시간을 설정하고,
균을 채취하여 흡광도를 측정하고 CFU 측정을 실시한다.
흡광도가 0.100 이상, 0.700 이하가 되는 범위에서 균 희석액을 제조하여 측정을 실시한다.
CFU 측정은 흡광도를 측정한 균 희석액을 10-fold dilution으로 106배까지 희석한 것을 측정하며,
CFU는 하나의 plate에서 균 수가 30-300개 사이가 나온 것을 고르고,
거기에 희석배수를 곱한 결과의 평균으로 한다.
3. 밸리데이션 결과분석 및 보고: 흡광도와 그 때의 CFU값을 사용하여
아래 그림과 같이 그래프를 작성하고 추세선을 그려 r2값이 0.998 이상인지 확인하고 추세선식을 구한 뒤 이를 정리하여 보고한다.
Linear regression
4. 표준작업지침서 작성: 표준작업지침서를 사용하는
시험 종류, 배양 조건, 시간, 흡광도 측정 조건 등을 구체적으로 명시하여 표준작업지침서를 작성한다.
5. 표준작업지침서에 따른 작업 실시: 공정 상 필요에 따라 표준작업지침서대로 흡광도를 측정하여
연속 작업 중 전배양액의 균 농도 설정을 위한 CFU 측정을 갈음한다.
6. 주기적인 재밸리데이션 및 SOP 검증: 전배양을 할 때마다 밸리데이션을 실시하며,
이때는 흡광도에 따라 예측되는 CFU에 맞춰 시험을 실시하고 결과값이 예측한 값에 맞는지 검증한다.
계절이나 기타 요인에 따라 결과값에 변동이 있다면
이를 반영하여 SOP를 수정하여 이를 반영할 수 있도록 한다.
☞ 위의 예시는 대수증식기 전배양액의 흡광도와 CFU 사이의 관계를 회귀분석을 통해
유의미한 상관성(r2=0.998 이상)이 있음을 검증하는 실험방법 밸리데이션입니다.
미생물 관련 수업을 들은 분들은 눈치채셨겠지만, 위 밸리데이션은 실험노트 작성법과 유사합니다.
실험 전 필요한 이론에 대해 예비조사를 실시하고
예비조사에서 얻은 정보를 바탕으로 시험방법과 시험조건을 설정한 뒤 시험을 실시하고
그 때 사용한 기기와 도구, 시약에 대한 정보를 삽입하며 결과를 확인하고 이를 해석하며
앞으로 개선할 점에 대해 고찰한 뒤 이를 실험노트에 작성하여 문서화하는 것까지,
실험 수업을 들으신 분들은 밸리데이션에 대해 이미 교육 받은 것과 마찬가지입니다.
그러므로, 연구원을 지망하시는 분들은 실험노트 작성이 밸리데이션에 대한 교육임을 인지하고
성실하고 꼼꼼하게 작성하면 추후 밸리데이션을 실시할 때 편하게 적응할 수 있습니다.
글 한국분석시험연구원 분석3팀 조인재 선임 연구원
t1@katr.re.kr
한국분석시험연구원
관리자