연구성과

안녕하세요 KATR 입니다.

오늘은 Western Blot 시험에 대한 정보 및 방법을 소개 드리려고 합니다.

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Western Blot이란?

Western Blot(WB) 시험은 단백질을 검출하고 분석하는 실험 기법으로, 특정 단백질의 존재 여부와 상대적인 발현량을 확인하는 데 사용됩니다.

이는 단백질의 크기와 특이적 항체 반응성을 이용하여 분석하는 기법으로, 생명과학 및 의학 연구에서 널리 활용됩니다.

사용되는 Cell line 목록

1) MRC5 (인간유래세포, 섬유아세포)/기본 세포주

2) CCD986SK (인간유래세포주- 주름/보습 세포)/기본세포주

3) RAW264.7 (마우스 면역세포주 – 항염 관련 실험 진행)

4) B16F10 (마우스 흑색종 세포- 미백관련 실험 진행)

5) HFDPC (모유두세포- 모발시험 진행)/가격에 +30만원

6) L929 (마우스 섬유아세포 – 의료기기 용출 실험에 주로 사용됨)

7) 3T3L-1 (지방전구세포- 항비만 및 당뇨 실험 진행)

* 분화유도 기간 10일 추가 필요

8) HepG2 (간암세포주 – 지방간 및 간 관련 실험 진행)

시료정보

분말 (DMSO를 용매로 하여 액상형태로 용해 가능), 기기 및 Gel (배지에서 용출 가능)

농도

1) 1-3가지 농도 진행

(원하는 농도가 있다면 제시, 없으면 MTT 진행 후 적정 농도에서 진행)

* 농도가 있는 경우 (uM, mg/ml)

* 농도가 없는 경우 원액을 100 %으로 두고 1%가 최대 처리 농도 (안내 필요)

항체 정보 (시험을 진행할 발현인자 선택) + 항체 비용 별도

1) 암세포 (p53, BCL-2, Caspase3)

2) 염증 반응 (IL-1α, IL-1β, IL-6, TNF-α, IFN-γ, TGF-β1, IL-10)

3) 미백 (TYRP-1, TYRP-2, MITF)

4) 항주름 (MMP-1, MMP-2, MMP-3, COL1A1, pro-COL1A1)

5) 피부장벽 (FLG, AQP-3, hBD, IVL, LOR, HAS )

6) 아토피 (IL-1α, IL-1β, IL-6, TNF-α, IFN-γ,TGF-β1, IL-10)

7) 항비만 (PPARγ, c/EBPa, SERB1)

8) 탈모 (β-catenin)

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시험방법

① 세포는 37 ℃, 충분한 습도, 5 % CO₂ 인큐베이션 시켜 유지한다.

② 100 파이 플레이트에 cell seeding (각 세포마다 seeding 되는 세포수 상이)

③ 시료를 각각 treat 한 다음 반응 시간만큼 인큐베이션 진행

④ 반응 시간이 지난 후 DPBS로 wash 해서 cell을 걷어 모은다.

⑤ cell을 걷어 모은 tube를 원심 분리하여 상층액을 제거하고 1 X RIPA Buffer (lysis buffer)를 200 µl이상 분주하고 1X Protease inhibitor buffer를 분주하여 sonication 또는 1 h 4 ℃ 반응

⑥ lysis가 진행된 cell을 원심분리 (13000 rpm, 15 min, 4 ℃) 하여 상층액만 회수하여 tube에 분주한다.

⑦ 회수된 단백질을 BCA assay kit를 사용하여 정량하고, 95 ℃, 5min heating 한 뒤, 30-40 ug의 단백질을 SDS-PAGE Gel에 내려 분자량 별로 잔백질을 분리한다.

* gel의 조성은 발현을 확인하고자 하는 단백질의 분자량에 따라 달라진다.

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⑧ transfer을 통해SDS-PAGE Gel에 분리한 단백질을 membrane으로 옮긴다.